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　　此外，根据术语Clq家族，蛋白质Clq、胶原α1(X)、α2(VII)、越冬(overwintering)蛋白质、ACRP30，内耳结构蛋白质、小脑肽和多聚体蛋白(multimerin)归类于蛋白质家族，因为它们的各自多聚化序列片段具有序列同源性(Kischore和Reid，Immunopharmacol.，42(1999)15-21)，并且由于它们的结构，这些蛋白质是较高聚集体的形式，例如三聚体。例如，在此家族中发现的具有多聚化性能的蛋白质中，已知来自补体系统的蛋白质Clq的结构特征是单体，这些单体的每一个具有一个已知为“头”的球形结构域和“胶原的(collagenaceous)”螺旋状序列片段。这种螺旋状序列片段形成卷曲螺旋式三股螺旋，由此发生单体的三聚化。接着，6个这些Clq三聚体形成寡聚体，接着蛋白质三聚体的寡聚化基于单独的卷曲螺旋式三股螺旋之间的相互作用。这种蛋白质或多-(寡-)聚化蛋白质复合体Clq的结构排列是一种还称为“花束”的构建体，它确保18个球状、C-末端排列的“头”域连接得到一种三聚体的六聚体。

　　文献还公开大量的在生理上作为信号分子的蛋白质仅能够转导处于特定状态的生物信号。因此，例如膜结合的FasL具有生物活性，即细胞凋亡活性，但从膜结合的片段(已知为sFasL)中消去细胞外蛋白片段之后，该非膜结合的sFasL部分不再能够在生理学上使靶细胞发生细胞凋亡作用。Schneider等人的公开.，Vol.187，No.8，1998，1205-1213)描述如何通过使用交联抗体实现在从膜结合的蛋白片段消去以后得到的上述sFasL三聚体的生物作用的生理功能的再活化。为此目的，构建并表达由FasL的三聚化结构域、短接头序列和flag标记(具有flag氨基酸序列(一字母编码)DYKDDDDK)组成的融合蛋白，通过指向对抗flag标记的抗体使这种非结构依赖性三聚化(即不通过导致形成超二级结构的特定的二级结构相互作用)融合蛋白发生交联。

　　术语生物活性蛋白质、蛋白片段或肽的功能衍生物具体指保持生物功能，特别是与相互作用的配偶体，如膜结合的受体结合的性能，但其序列表现出与对应的天然序列不同的蛋白质。这些序列衍生物可以采用一种或多种插入、缺失和/或置换的形式，所用的衍生物和天然序列之间的序列同源性优选为至少70％，更优选至少85％，特别优选至少90％。术语功能衍生物具体涵盖具有与生理序列比较有更保守置换的氨基酸序列。术语保守置换指同类氨基酸彼此交换的置换。具体而言，存在具有脂肪族侧链、带正电或负电的侧链、位于侧链的芳基的氨基酸，或者侧链能够形成氢桥键，例如具有羟基官能的侧链的氨基酸。这意味着例如具有极性侧链的氨基酸被另一个具有相同极性的侧链的氨基酸置换，或例如以疏水侧链为特征的氨基酸被另一个具有同样的疏水侧链的氨基酸置换(例如丝氨酸(苏氨酸)被苏氨酸(丝氨酸)置换，或者亮氨酸(异亮氨酸)被异亮氨酸(亮氨酸)置换)。插入和置换具体可能存在于不发生空间结构变化或涉及结合区域的序列位置。例如，可以借助CD光谱(圆二色谱)容易地检测插入或缺失导致的空间结构的变化(Urry，1985，Absorption，circular Dichroism和ORD of Polypeptides，inModern Physical Methods in Biochemistry，Neuberger等人(Ed.)，Elsevier，Amsterdam)。例如在以下出版物中公开了用于产生具有包含相较于天然序列的置换的氨基酸序列的蛋白质的适宜的方法US4,737,462、US 4,588,585、US 4,959,314、US 5,116,943、US 4,879,111和US 5,017,691。Sambrook等人(1989，Molecular CloningA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press)也具体描述了衍生物的产生，它可遗漏、补充或置换密码子。其它衍生物可以具体为这样的蛋白质该蛋白质被稳定以避免生理学降解，例如通过取代酰胺类型键，如还可以使用β-氨基酸稳定蛋白质主链。

　　重组融合蛋白的三聚体具体优选的情况是该重组融合蛋白中的组分A是来自TNF细胞因子家族的细胞因子，这种TNF细胞因子的片段，或者TNF细胞因子或对应的TNF细胞因子片段的功能衍生物。通过与对应的受体在体内结合(例如在以较高级聚集体的形式结合的情况下)，用于靶细胞的TNF细胞因子的生物作用可以导致诸如细胞凋亡、增殖或激活等作用，但这些三聚体一般仅确保与所关注的受体结合而不再发挥激活功能。在一个非限制性的列举中，适宜的TNF细胞因子和因此的适宜的融合蛋白中的组分A，具体为蛋白质OX40L、RANKL、TWEAK、Lta、Ltab2、LIGHT、CD27L、41-BB、GITRL、APRIL、VEGI和BAFF或它们的片段或衍生物。非常具体优选蛋白质CD40L、FasL、TRAIL、TNF(特别是与受体TNF-R2结合的TNF)、CD30L和EDA或者它们的片段或衍生物。优选使用的重组融合蛋白中的组分A是上述膜结合的TNF细胞因子的细胞外片段或它们的功能衍生物。这些裂解产物在保持它们对所关注的受体的结合能力时非常特别优选。上述TNF细胞因子或TNF细胞因子的片段的上述意义的功能衍生物还可以用作融合蛋白的组分A。在一个非常优选的实施方案中，重组融合蛋白的组分A是本发明三聚体的组分，它选自hFasL(AA139-281)、hTRAIL(AA9 5-281)、hCD40L(AA 116-261)和m或hTNFα(AA 77-235)。

　　因此，根据本发明以下可能结果已经以在三聚体形式存在于溶液中选择重组融合蛋白的组分A，而该重组融合蛋白将成为本发明寡聚物的组分。在这种情况下，组分B将更进一步促进组分A的三聚化。例如这种情况发生在已在溶液中发生典型的三聚化的组分A如TNF配体或它的片段或衍生物进一步被组分B稳定化为它的三聚形式的时候。相反，在重组融合蛋白的组分A本身在溶液或体内不表现出表面相互作用调节的三聚体结构的情况下，本发明的组分B必须确保重组融合蛋白的组分A的三聚化。后者的情况是例如典型地当仅天然蛋白质的片段同样不能三聚化或至少在体内不以三聚体形式存在的时候，例如因为平衡向单体大大转移，也就是说，例如细胞因子的片段，特别是以下C-末端片段(例如包含来自C末端的至少100 AA(在每种情况下根据C末端计算)，优选至少120 AA，特别优选至少150AA)FasL、CD40L、CD30L、TRAIL、EDA或TNF用作重组融合蛋白的组分A。

　　但是在一个优选的实施方案中，重组融合蛋白的组分A还可以采用本发明的氨基酸序列的形式，其适于用作受体激动剂或受体拮抗剂的载体。因此，例如药理学活性小有机化学分子一般可以共价偶联成这种氨基酸序列，例如通过与苏氨酸或丝氨酸形成的醚键，一种类酰胺键或者通过酯键共价偶联。这种偶联的激动剂或拮抗剂可以增大本发明三聚体的结合常数，优选将其增大到至少10-9M-1，或者可以调节生物活性，特别是本发明三聚体的抑制行为，尤其是关于抑制细胞凋亡信号级联的触发。此外，本发明的三聚体可以用作药理学活性物质的载体。通过选择适宜的载体，可以这种方式将本发明的三聚体，一种药理学活性成分选择性地转运到特定细胞的附近空间，而这些特定的细胞构成这些活性成分的药理学靶体。例如一种可能性是使这种活性成分与FasL三聚体偶联，FasL三聚体的结合阻断FasR(从而根据本发明，以这种方式抑制细胞凋亡，安全地保护所述细胞的存活)，并使活性成分直接应用于靶细胞。这种系统的一种可能的应用例如可以是三聚体与细胞毒性物质如活性成分连接导致的，所述的物质阻止免疫细胞攻击靶细胞，例如在发生变性，特别是神经变性疾病，尤其是帕金森氏病或阿耳茨海默氏病的情况下。这样根据本发明在帕金森氏病的情况下可以因此防止黑质中产生多巴胺的细胞的凋亡。因此本发明总体上公开了本发明的这种载体系统和，如果合适的话共价偶联活性成分的组分用作人或兽医的药物的应用。

　　除了组分A和B之外，该融合蛋白可以包括其它序列片段。在上下文本中，优选用于本发明目的的序列是已知为标记序列，如至少一个flag标记序列，即氨基酸序列DYKDDDDK，和/或例如至少一个组氨酸标记(包括若干连续的组氨酸，例如至少5个)和/或其它标记序列或抗原序列。此外，本发明的融合蛋白的各种片段(组分A、B或标记序列，也可以是在本发明的融合蛋白中存在的两个或更多个组分A)可以通过接头序列彼此分离。这些接头序列(至少2AA，优选至少5AA)用于重组融合蛋白中各种功能性组分的结构界定，并还可以优选发挥“绞链”功能，即具有柔性结构的氨基酸序列。特别优选包括至少一个蛋白酶剪切位点的接头，它使组分A能与组分B分离。该接头中的蛋白酶剪切位点优选是凝血酶共有序列。

　　本发明的三聚体适于生产药物或用于治疗疾病或病症以进行医学应用，即用于人和兽医学，特别是当组分A为信号蛋白或这种信号蛋白的片段或所述蛋白质或片段的衍生物。可以用本发明主张的三聚体(异源或同源三聚体)治疗大量的疾病或病症。它们具体应用于在这些症状中观察到各种生理学配体的细胞外浓度增大或膜结合的受体的数量增大的时候。实例是细胞本身的膜结合的信号分子如TNF细胞因子(例如FasL)或可溶性信号分子如由于蛋白酶剪切而可溶的TNF细胞因子的浓度增大。在一个非限制性的举例中，本发明的这种三聚体可以用于例如生产治疗过度炎症、自体免疫疾病、基于过度细胞凋亡反应，或者变性的疾病，特别是神经变性疾病(例如帕金森氏病)的药物，如果合适的话还病毒感染。本发明的三聚体在以下情况下非常特别地合适当所述疾病要求意在防止天然细胞因子的生物活性的治疗，即用于阻断对应的细胞因子受体。提及的实例为治疗病毒性肝炎(HBV，HCV)、酒精性肝炎病、胆汁淤积性肝炎、威尔森病、由自体免疫系统无功能导致的肝炎，治疗以下肝移植排斥反应GvHD、TEN(毒性表皮坏死松解症)、桥本甲状腺炎或多发性硬化。

　　每一种本发明的三聚体或形成本发明的三聚体的宿主细胞，或者编码能够形成三聚体的重组融合蛋白的DNA序列，或者适宜的表达载体可以本身作为药物或用于生产药物。但是，它们还可以用作与其它活性成分组分或药学助剂、载体或添加剂组合的药物。因此，本发明的三聚体或本发明的另一主题可以与药学上可接受的载体、助剂和/或添加剂结合成为组分。因此本发明还公开了包括本发明的主题，特别是本发明的三聚体的(药物)组合物。适宜的制备方法公开在“Remington′s Pharmaceutical Sciences”，Easton，PA，1980)，这里引用该文献的内容作为参考。例如，用于肠胃外给药的适宜的载体为无菌水、无菌盐水、聚亚烷基二醇、氢化萘，特别是生物相容的交酯聚合物、交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物。本发明的组合物可以包括填充剂或诸如以下的物质乳糖，甘露醇，用于将聚合物如聚乙二醇共价连接到本发明的抑制剂上、与金属离子络合或将材料包含在特定的聚合物化合物制剂内部或上面的物质，例如聚乳酸、聚乙酸、水凝胶或脂质体、微乳剂、胶束、单层或多层脂质体、红细胞片段或原生质球。各组合物的实施方案的选择取决于物理行为，例如根据溶解度、稳定性、生物利用度或降解性。本发明的组合物中受控或恒定释放的活性成分组分包括基于亲脂贮存物(例如脂肪酸、蜡或油)的配方。本发明的物质的包衣或包括这些物质的组合物，即含聚合物的包衣同样在本发明的公开范围之内(例如泊洛沙姆或poloxamines)。而且，可以提供具有保护性包衣，例如蛋白酶抑制剂或渗透剂的本发明的物质或组合物。

　　这里描述的本发明的另一个主题是适于进行[缺漏]三聚化的融合蛋白，条件是该重组融合蛋白包括至少一种组分A和至少一种组分B，组分A包括一种具有生物功能，特别是对抗体或受体的配体功能的蛋白质或蛋白片段，而组分B包含三聚化片段或这种蛋白片段的功能衍生物，如上述作为本发明的三聚体的组分的片段。因此，所有这些重组融合蛋白为以上公开的作为本发明的三聚体组分的本发明公开的重组融合蛋白。因此以上的公开-关于本发明的三聚体-关于组分A和B和关于重组融合蛋白的构建对应于本发明的重组蛋白质的实施方案。因此，本发明重组融合蛋白的组分B通常是一种选自Clq蛋白质家族或胶原凝集素家族，或者选自胶原蛋白家族的蛋白片段；而该重组融合蛋白的组分B优选排它地包括三聚片段，但不包含三聚体寡聚结构或球形“头”域。因此通常组分B将包括至少一个具有七氨基酸模式的氨基酸序列(abcdefg)n，该氨基酸序列在结构上形成一种形成三股螺旋的螺旋，其中在位置a和d的氨基酸优选与它们的非极性侧链连接，因而能够形成上述的超螺旋结构，在这种情况下三股螺旋由三条螺旋组成。这种至少一个七氨基酸模式，优选至少2个七氨基酸模式的序列可以来自例如以下蛋白质之一的角蛋白胶原、Clq、MBP、SP-A、SP-D、BC、CL43或ACRP30。上述蛋白质的这种片段的功能衍生物也可以在本发明的范围内使用，以上选择的组分A的功能衍生物的定义也类似地适用于组分B。

　　本发明的其它主题是一种由于形成二硫桥键(ApoFasL-060)而在体外在溶液中作为六聚体(2×3)存在的抑制剂。这种抑制剂在体内存在-如果合适的话存在于氧化介质-以三聚体形式存在，或者表现为类似三聚体的方式，因而发挥抑制性能。ApoFasL-060由N-末端flag序列、接头和特定的接头与来自hFasL的AAs 103-138，同样来自hFasL的AAs139-281(组分A)组成(见图1)。类似地，作为组分A的ApoFasL-060类型的抑制剂还可以具有对应的其它TNF细胞因子的结合片段，例如OX40L、RANKL、TWEAK、Lta、Ltab2、LIGHT、CD27L、41-BB、GITRL、APRIL、VEGI和BAFF或它们的片段或衍生物。非常特别优选蛋白质CD40L，FasL，TRAIL，TNF(特别是与受体TNF-R2结合的TNF)、CD30L和EDA和它们的片段和衍生物，尤其是它们各自的人序列。

　　图3显示体内实验的结果，即ApoFasL-060对激动性抗Fas抗体J02诱导的肝细胞溶解的抑制作用。图3A显示实验的结果，其中对小鼠在静脉内注射5μg的J02抗体之前静脉内注射ApoFasL-060(25μg/小鼠)或盐水(对照)。图3A中的实心棒条代表ALT的血清滴定度(以U/ml为单位)，而空心的棒条代表AST的，作为静脉注射注射后4小时的测定结果。右边的图表示对照实验的结果。图3B表示小鼠的存活率，该小鼠已在用盐水溶液(实心棒条)或ApoFasL-060(20μg)(浅灰色棒条，在每种情况下为从左开始的第二个棒条)预处理或仅用ApoFasL-060(深灰色棒条，在每种情况下为从左开始的第三个棒条)或ApoFasL-060和交联抗体(中等灰色棒条，在每种情况下处在右边)预处理之后接受10μg的J02抗体，将所述存活率作为给药后经过的时间(2小时、4小时、24小时)的函数。在4小时后，仅接受激动性J02抗体(黑色棒条)的小鼠无一存活，而抑制剂(浅灰色棒条)使基本上所有的小鼠存活。因此，ApoFasL-060防止激动性抗Fas抗体J02对小鼠的致死作用。进而交联抗体取消ApoFasL-060(中等灰色棒条)的抑制作用。

　　图8记录Fas-ACRP30的体外在A20细胞中抗FasL介导的细胞凋亡的抑制作用。在Y轴上绘制在490nm处的吸光率(细胞存活力测定；还参照图2)，而在X轴上绘制以ng/ml为单位的所关注的融合蛋白的浓度。将Fas-ACRP30的抑制作用与Fas-Fc，Fas的二聚体形式的抑制作用和Fas-COMP，Fas的五聚体形式的抑制作用进行比较。所用的细胞凋亡诱导剂是本发明的FasL嵌合体，FasL-199。Fas-ACRP30构建体抑制FasL诱导的细胞凋亡，且其IC50值为80ng/ml。此值与五聚Fas衍生物Fas-COMP(35ng/ml)的值相当，而(二聚)FasFc的IC50值大于1μg/ml。

　　(d)细胞毒性试验基本上如上述Schneider等人(J.Biol.Chem.27218827-18833，1997)所述完成细胞毒性试验。这里在100μl培养基中将50 000个细胞培养16小时，所述培养基包括存在或不存在1μg/ml M2抗体的以上所示的配体浓度。借助PMS/MTS(phenanzine硫酸二甲酯3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-5-[3-羰基甲氧基苯基]-2-[4-磺苯基]-2H-四氮唑，盐)(PromegaCorp.，Madison，WI)测定细胞存活率。使颜色在需要的时间内发育(一般1-3小时)。在490nm处测定吸光率。490nm处的光密度是细胞存活力的度量(高光密度对应于加入物质的低细胞凋亡作用，从而对应于高细胞存活力)。

　　应用实施例3诱导肝细胞溶解后的体内实验A.ApoFasL-060的作用为此目的，给小鼠注射激动性J02-抗-Fas抗体，从而由于暴发性肝功能衰竭而导致处理小鼠死亡。通过高氨基酸转移酶(AST和ALT)血清滴定度来检测这些小鼠的肝细胞溶解。用ApoFasL-060(1mg/kg)对小鼠进行实验预处理，从而保护在给动物施用J02抗体之后免于由后者触发的肝功能衰竭(肝细胞溶解)(参见图3A)。如所预期的，ApoFasL-060的保护作用是依赖于剂量的。当施用5μg的J02抗体时，所观察到的AST和ALT滴定度对应于对照小鼠的那些。在10μg的J02抗体的剂量下，观察到显著的保护作用(AST和ALT滴定度降低大约90％)。因此结果是，除非使用一种交联抗体(图3B)，ApoFasL-060本身不具有毒性，因而细胞凋亡抑制作用的也基于与Fas受体的结合而不触发死亡信号。

　　应用实施例4对乙酰氨基酚(AAP)诱导的肝炎的抑制对乙酰氨基酚(AAP)，一种止痛药，已知诱导暴发性肝功能衰竭。其分子机理基于Fas介导的细胞凋亡。因此在本应用实施例中研究了三聚ApoFasL-267和/或六聚ApoFasL-060保护肝细胞免于AAP诱导的细胞凋亡的可能性。为此目的，给小鼠腹膜内注射次致死剂量的AAP(0.3g/kg)。5小时后，通过测定ALT和AST血清滴定度而测定肝损害。根据IFCC(国际临床化学联盟)指南在酶试验中测定ALT和AST滴定度。施用ApoFasL-267或ApoFasL-060防止AAP导致的AST或ALT滴定度增大。与未处理的小鼠相比，对已根据本发明预处理的小鼠进行观测时的氨基转移酶滴定度显著降低(75-90％)。

　　B.Fas-ACRP30对FasL介导的细胞凋亡的抑制作用为了证明本发明的融合蛋白Fas-ACRP30对FasL介导的体外细胞凋亡的抑制作用，用增加的Fas-ACRP30浓度预培养FasL-敏感性A20细胞，然后加入寡聚FasL。本发明的构建体FasL199具体用作本实验中的特别有效FasL寡聚体。以这种方式将本发明的构建体Fas-ACRP30的作用与Fas的二聚体形式(Fas-Fc)和Fas的五聚体形式(Fas-COMP)的作用进行比较。如图8所示，80ng/ml的Fas-ACRP30浓度可以导致FaSL介导的细胞凋亡降低大约50％。此值显著低于二聚的对比构建体Fas-Fc的值(IC50＞1μg/ml)。IC50为35ng/ml的Fas-COMP的抑制作用与Fas-ACRP30的抑制作用相当。因此这些数据证实Fas-ACRP30是一种有效的FasL介导的细胞凋亡的抑制剂。