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　　基于纤连蛋白的支架是一个能够演化而结合任何感兴趣化合物的蛋白质家族。这 些蛋白质(一般利用自纤连蛋白III型0 或而3样结构域衍生的支架)以天然或工程 抗体(即多克隆、单克隆、或单链抗体)特征性的方式发挥功能，而且还具备结构优点。具 体而言，这些抗体模拟物的结构被设计以实现最佳折叠、稳定性、和溶解度，甚至在正常情 况下导致抗体结构和功能丢失的条件下亦是如此。基于纤连蛋白的支架蛋白的一个例子是 Adnectins (Adnexus, 一家 Bristol-Myers Squibb 石if发公司)。纤连蛋白是一种在细胞外基质的形成和细胞-细胞相互作用中发挥至关重要作 用的大型蛋白质；它由三类(I型、II型、和III型)小型结构域的许多重复组成(Baron et al.，1991)。Fn3自身是一个大型亚家族的范式，该亚家族包括细胞粘附分子、细胞表面 激素和细胞因子受体、伴侣蛋白(chaperoning)、和碳水化合物结合域的一部分。综述参见 Bork&DooIittle,Proc Natl Acad Sci USA. 19920ct 1 ；89(19) :8990-4 ；Bork et al. ,J Mol Biol.1994 Sep 30 ；242 (4) :309-20 ；Campbell&Spitzfaden, Structure. 1994May 15; 2(5) :333-7 ；Harpez&Chothia, J Mol Biol. 1994May 13 ；238 (4) :528-39)。纤连蛋白III型0^3)结构域包含(N端至C端的次序)β或β样链Α、环ΑΒ、β 或β样链B、环BC、β或β样链C、环CD、β或β样链D、环DE、β或β样链Ε、环EF、β 或β样链F、环TO、和β或β样链G。任何或所有环AB、BC、CD、DE、EF和re可参与靶物 结合。BC、DE、和TO环在结构和功能上都与来自免疫球蛋白的互补决定区(OTR)类似。美 国专利No. 7，115，396记载了这样的而3结构域蛋白质，其中通过对BC、DE、和TO环的改变 获得了高亲和力TNFa结合物。美国专利申请公开No. 2007/01481 记载了这样的而3结 构域蛋白质，其中通过对BC、DEJP TO环的改变获得了高亲和力的VEGFR2结合物。为治疗和诊断目的获得改良的纤连蛋白结构域支架蛋白会是有利的。本公开内容 提供这样的改良的蛋白质。发明概述本申请的一个方面提供多价多肽，其包含N端结构域和C端结构域，该N端结构 域包含以小于500nM的Kd结合第一靶物分子的第一纤连蛋白III型第10结构域(kiFM)， 该C端结构域包含以小于500nM的Kd结合第二靶物分子的第二 ’113。在一些实施方案中，第一和第二 1(1而3结构域是藉由多肽接头连接的，所述多肽接头诸如例如具有1-100、1_50、 1-20、1-10、5-50、5-20、5-10、10-50、或10-20个氨基酸的多肽。在一些实施方案中，第一和 第二 1(1而3结构域是藉由选自基于甘氨酸-丝氨酸的接头，诸如SEQ ID N0:21和22的多 肽连接的。在一些实施方案中，第一和第二 1(1而3结构域是藉由SEQ ID N0:20所示的多肽 连接的。在一些实施方案中，第一和第二 结构域是藉由选自基于甘氨酸-脯氨酸的接 头，诸如SEQ ID N0:32、33、和34的多肽连接的。在一些实施方案中，第一和第二 1(^n3结 构域是藉由选自基于脯氨酸-丙氨酸的接头，诸如SEQ ID N0:60、61和62的多肽连接的。每个lFr^结构域包含环AB、环BC、环CD、环DE、环EF、和环FG，而且每个°Fn3结 构域独立地在选自环BC、DE和TO中的至少一个环中具有相对于人呷113结构域的相应环的 序列发生了改变的氨基酸序列。每个所述结构域包含与SEQ ID NO :1所示的天然存 在人uiFr^结构域至少50、60、70、或80%相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一 ’113结构域以小于IOOnM的Kd结合第一靶物分子，而且 第二 kiFM结构域以小于IOOnM的Kd结合第二靶物分子。在一些实施方案中，第一靶物分 子和第二靶物分子是相同的。在一些实施方案中，第一靶物分子和第二靶物分子是不同的。 在一些实施方案中，第一靶物分子是IGF-IR，而且第二靶物分子是VEGFR2。在一些实施方 案中，第一靶物分子是VEGFR2，而且第二靶物分子是IGF-IR。在一些实施方案中，kiFM结构域的至少两个环发生了改变。在一些实施方案中， 环BC和环TO具有相对于人kiFi^结构域的相应环的序列发生了改变的氨基酸序列。在一 些实施方案中，1(1而3结构域的至少三个环发生了改变。在一些实施方案中，kiFM结构域的 至少两个环结合靶物分子。在一些实施方案中，kiFM结构域的三个环结合靶物分子。在一些实施方案中，第一和/或第二 1(1而3结构域在其C端连接至选自SEQID NO 17、18、19、50、51、52、71 或 72 或 E、EI、EID、ES、EC、EGS、或 EGC 的氨基酸序列。在一些实 施方案中，第一 uiFr^结构域在其C端连接至氨基酸序列SEQ ID NO :19或50、或Ε、EI、或 EID0在一些实施方案中，第二 结构域在其C端连接至氨基酸序列SEQ ID NO :17,18, 51、52、71 或 72。在一些实施方案中，提供包含与SEQ ID NO :8-15 J9-31和63-70中的任一序列至 少70、80、90、95、或100%相同的氨基酸序列的多价多肽。在一些实施方案中，多价多肽还包含一个或多个选自下述各项的药动学(PK)模 块聚氧化烯模块、人血清白蛋白结合蛋白质、唾液酸、人血清白蛋白、运铁蛋白、IgG、IgG 结合蛋白、和Fc片段。在一些实施方案中，Hi模块是聚氧化烯模块且所述聚氧化烯模块是 聚乙二醇(PEG)。在一些实施方案中，PEG模块经Cys或Lys氨基酸共价连接于多价多肽。 在一些实施方案中，PEG介于约0. 5kDa和约IOOkDa之间。在一些实施方案中，1 模块改善多肽的一项或多项药动学特性，例如生物利用度、 血清半衰期、体内稳定性、和药物分布。在一些实施方案中，相对于单独的多价多肽，I3K模块 将多价多肽的血清半衰期延长至少 20、30、40、50、70、90、100、120、150、200、400、600、800% 或更多。在一些实施方案中，所述进一步包含Hi模块的多价多肽具有至少1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、11、12、13、或14天的血清体内半衰期。在一些实施方案中，1 模块和1(1而3结构域是藉由至少一个二硫键、肽键、多肽、聚 合糖(polymeric sugar)、或聚乙二醇模块连接的。在一些实施方案中，I3K模块和结

　　5构域是藉由包含氨基酸序列SEQ ID NO :17，18，或20的多肽连接的。在一些实施方案中，多价多肽进一步包含结合模块。在一些实施方案中，多价多 肽进一步包含抗体模块。在一些实施方案中，抗体模块小于50KDa。在一些实施方案中，抗 体模块小于40KDa。在一些实施方案中，抗体模块是单链Fv(ScFv)、Fab片段、Fab片段、 F(ab )2、二硫化物连接的Fv(SdFv)、Fv、双抗体、或完整抗体。在一些实施方案中，抗体 模块是单域抗体。在一些实施方案中，抗体模块结合人蛋白质。在一些实施方案中，抗体 模块结合 IGF-IR、FGFRU FGFR2、FGFR3、FGFR4、c_Kit、人 pl85 受体样酪氨酸激酶、HER2、 HER3、c-Met、叶酸受体、PDGFR、VEGFRl、VEGFR2、VEGFR3、人血管内皮生长因子(VEGF) A、 VEGF C, VEGF D、人 CD20、人 CD18、人 CDlla、人凋亡受体-2 (Apo_2)、人 α 4β 7 整联蛋白、人 GPIIb-IIIa整联蛋白、干细胞因子(SCF)、EGFR、或人CD3。在一些实施方案中，多价多肽进一步包含脂笼蛋白衍生物、四连蛋白衍生物、 avimer、或锚蛋白衍生物。在一些实施方案中，多价多肽结合人蛋白质。在一些实施方案 中，多价多肽结合IGF-IR、FGFRl、FGFR2、FGFR3、FGFR4、c-Kit、Apl85受体样酪氨酸激酶、 HER2、HER3、c-Met、叶酸受体、PDGFR、VEGFRl、VEGFR2、VEGFR3、人血管内皮生长因子(VEGF) A、VEGF C, VEGF D、人 CD20、人 CD18、人 CDlla、人凋亡受体-2 (Apo_2)、人 α 4β 7 整联蛋白、 人GPIIb-IIIa整联蛋白、干细胞因子(SCF)、EGFR、或人CD3。在一些实施方案中，多价多肽进一步包含藉由至少一个二硫键、肽键、多肽、聚合 糖、或聚乙二醇模块(PEG)连接的结合模块。在一些实施方案中，PEG介于约0.5kDa和约 IOOkDa之间。在一些实施方案中，PEG是藉由Cys或Lys残基缀合于多肽和结合模块的。在一个方面，本申请提供经过去免疫化(deimmunized)以消除一个或多个T细胞 表位的多价多肽。在一个方面，本申请提供经过去免疫化以消除一个或多个B细胞表位的 多价多肽。在一个方面，本申请提供一种多价多肽，其中1(1而3结构域是通过包括下述步骤 的方法选择的a)生成一群候选核酸分子，每个核酸分子包含与人而3结构域编码序列不 同的候选纤连蛋白III型(1(1而3)结构域序列，所述核酸分子各自包含可操作连接至所述 候选wFM结构域编码序列的翻译起始序列和起始密码子且各自在3末端可操作连接于 核酸-嘌呤霉素接头；b)在体外翻译所述候选kiFM结构域编码序列以生成一群候选核 酸」°Fn3融合物；c)使所述一群候选核酸」°Fn3融合物与靶物分子接触；并d)选择这样的 核酸」°Fn3融合物，其蛋白质部分对靶物分子的结合亲和力或特异性相对于所述人1(1而3对 靶物分子的结合亲和力或特异性有所改变。在一些实施方案中，对于所选择的核酸」°Fn3 融合物通过下述方式加以进一步优化改变一个或多个核酸残基并再次用靶物分子筛选融 合物以选择改良的结合物(improved binders) 0在一些实施方案中，候选核酸分子是RNA。 在一些实施方案中，候选核酸分子是DNA。在一个方面，本申请提供包含多价多肽的药学可接受组合物。在一些实施方案中， 组合物基本上不含内毒素。在一些实施方案中，组合物基本上没有微生物污染，使之适合于 体内施用。组合物可配制成例如供IV、IP或皮下施用。在另一个方面，本申请提供编码本文所述多价多肽的核酸。还包括包含此类蛋白 质的多核苷酸的载体。合适的载体包括例如表达载体。本申请的又一个方面提供包含编码 多价多肽的多核苷酸、载体或表达载体的细胞。序列优选经过优化以使在所使用的细胞类型中的表达最大化。优选的是在大肠杆菌中表达。也可以在例如真核微生物(包括酵母，例 如毕赤氏酵母(Pichia)或酿酒酵母(cervaisea))或蓝绿藻中表达多价多肽。可以改造酵 母细胞以产生期望的糖基化。本发明的细胞可以是哺乳动物细胞。在一个方面，可以改造 哺乳动物细胞以产生期望的糖基化。在一个方面，细胞表达基于纤连蛋白的支架蛋白。在 一个方面，编码基于纤连蛋白的支架蛋白的多核苷酸经过密码子优化以便于在所选择的细 胞类型中表达。还提供了用于生产本文所述多价多肽的方法，包括培养包含编码多价多肽 的核酸、包含所述核酸的载体、或表达载体的宿主细胞并自培养物回收所表达的多价多肽。附图简述

　　图15。HEK293/KDR和PAE/KDR细胞表达VEGFR2和IGF-IR，而且这两种受体在它 们的关联配体存在下活化。用VEGF、IGF1、或这两种因子(VEGF/IGF1)刺激经KDR(VEGFR2) 转染的HEK293和PAE细胞。对细胞溶胞物的^festern印迹探查磷酸化VEGFR(p_Flk_l/ Tyr996)、磷酸化IGF-IR、磷酸化Akt、磷酸化MAPK、或总肌动蛋白。图16。基于纤连蛋白的支架多聚体阻断VEGFR2和IGF-IR配体诱导的磷酸化 且抑制HEK293/KDR细胞增殖。如实施例8中所述用VEGF和IGFl (“指示不刺激的 对照)及纤连蛋白支架结构域蛋白处理细胞。对细胞溶胞物的Western印迹探查磷酸化 VEGFR(p-Flk-l/Tyr996)、总 VEGFR(Flk-I)、磷酸化 IGF-IR、总 IGF-IR、磷酸化 Akt、总 Akt、 磷酸化MAPK、总MAPK、或总肌动蛋白。暴露于各种构建物后通过[3H]-胸苷掺入评估细胞增 殖，而且以 IC5tl 报告结果。如所示的‘GS5 (SEQ ID NO 21)和GSlO (SEQ ID NO 22)。图17。基于纤连蛋白的支架多聚体阻断VEGFR2和IGF-IR配体诱导的磷酸化 且抑制HEK293/KDR细胞增殖。如实施例8中所述用VEGF和IGFl及纤连蛋白支架结构 域蛋白处理细胞。对细胞溶胞物的Western印迹探查磷酸化VEGFR(p Flk_l/Tyr996)、总 VEGFR(Flk-I)、磷酸化IGF-IR、总IGF-IR、磷酸化Akt、总Akt、磷酸化MAPK、总MAPK、或总肌 动蛋白。暴露于各种构建物后通过[3H]-胸苷掺入评估细胞增殖，结果作为IC5tl报告。如 所示的‘GS5 (SEQ ID NO 21)和GSlO (SEQ ID NO :22)。图18。细胞增殖测定法暴露72小时后HMVEC细胞中各种基于VAwFr^的结合 物的效果。图19。Western印迹分析将HMVEC-L细胞暴露于渐增浓度的各种构建物1小时， 接着用VEGF/IGF-1配体(二者终浓度均为50ng/ml)于37°C活化10分钟，之后溶胞。通过 在相对于用作加载对照的GAPDH标准化之后比较未处理的对经处理的样品中磷酸信号的 比来测量对pIGF-lR、pAkt、和pMAPK活性的抑制。图20。Western印迹分析将他41细胞暴露于渐增浓度的化合物1小时，接着用 IGF-I配体(50ng/ml)于37°C活化10分钟，之后溶胞。通过在相对于用作加载对照的GAPDH 标准化之后比较未处理的对处理的样品中磷酸信号的比来测量对PlGF-IR和pAkt活性的 抑制。图21。暴露1小时后各种构建物对HMVEC-L细胞中钙释放的影响。将细胞在EBM 培养基中血清饥饿过夜，然后在渐增量的各种构建物存在下温育1小时。用50ng/ml VEGF 配体刺激细胞。添加配体后60秒测量Ca2+通量。图22。PEG化的、有his标签的385A08-Fn-V2B_cys在RH-41肿瘤异种移植物模 型中在单剂量水平的抗肿瘤活性。Ajx周χ 3方案后的生长曲线。B.百分比生长抑制图， 证明了在一个TVDT内与溶媒处理组相比大于50%的TGI。(▼)指示的是给药方案。图23。PEG化的、有his标签的385A08-Fn-V2B_cys在RH-41肿瘤异种移植物模 型中在多剂量水平的抗肿瘤活性。A、B、C、和D中列出每种药剂的制定剂量水平。(▼)指示 给药方案。图M。PEG化的、有his标签的385A08-Fn-V2B-cys在A549肿瘤异种移植物肺模 型中在多剂量水平的抗肿瘤活性。A和C中显示指定剂量水平，B和D中显示相应的％TGI。 (▼)指示给药方案。

　　图25。PEG化的、有his标签的385A08-Fn-V2B_cys在GEO肿瘤异种移植物结肠 模型中在多剂量水平的抗肿瘤活性。A和C中显示指定剂量水平，B和D中显示相应的％ TGL· (▼)指示给药方案。图26。A673尤因肉瘤异种移植物肿瘤中由PEG化的、有his标签的 385A08-Fn-V2B-cys 介导的肿瘤生长抑制与 mononectin PEG_V2B_short ( 一种 PEG 化的抗 VEGFR-2adnectin)可比较。图 27。385A08-Fn-V2B_cys (有 his)的药动学参数。图 28。385A08-Fn-V2B-cys (有 his)和 mVEGF-A 对携带 A673 肿瘤的裸鼠 IP 施用 20和200mg/kg后的拟合的与观察到的血浆浓度-时间图谱的对照。图四。385A08-Fn-V2B-cys (无his)和mVEGF-A对携带A673肿瘤的裸鼠IP施用 20和200mg/kg后的拟合的与观察到的血浆浓度-时间图谱的对照。图 30。猴中 385A08-Fn-V2B_cys (有 his)的药动学参数。图 31。385A08-Fn-V2B-cys (有 his)和 hVEGF-A 对猴 IV 施用 3 和 30mg/kg 后的 拟合的与观察到的血浆浓度-时间图谱的对照。图32。猴中385A08-Fn-V2B_cys (无his标签)的药动学参数。图 33。385A08-Fn-V2B-cys (无 his)和 hVEGF-A 对猴 IV 施用 3mg/kg (第 1 剂) 后的拟合的与观察到的血浆浓度-时间图谱的对照。发明详述定义“多肽”指两个或更多个氨基酸的任何序列，无论长度、翻译后修饰、或功能。“多 肽”、“肽”、和“蛋白质”在本文中可互换使用。多肽可包括天然氨基酸和非天然氨基酸，诸 如美国专利No. 6，559,1 (通过述及收入本文)中披露的那些。还可以以多种标准化学方 式中任一方式修饰多肽(例如可以用保护基团修饰氨基酸；可以将羧基末端氨基酸变成末 端酰胺基团；可以用基团修饰氨基末端残基以例如增强亲脂性；或者，可以化学糖基化或 以其它方式修饰多肽以提高稳定性或延长体内半衰期)。多肽修饰可包括将另一结构(诸 如环状化合物或其它分子)搭接到多肽上，而且还可包括包含一个或多个构型发生了改变 的(例如R或S ；或者L或D)的氨基酸的多肽。术语“PK”与“药动学”同义，涵盖化合物包括例如下列在内的特性受试者对 它的吸收、分布、代谢、和清除。“Hi调控蛋白”或“Hi模块”指任何在与生物学活性分子 融合或一起施用时可影响生物学活性分子的药动学特性的蛋白质、肽、或模块。1 调控 蛋白或Hi模块的例子包括PEG、人血清白蛋白(HSA)结合物(如美国专利申请公开文本 No. 2005(^87153和20070003M9中所公开的)、人血清白蛋白、Fc或Fc片段、和糖(例如 唾液酸)。“功能性Fc区”拥有天然序列Fc区的至少一项“效应器功能”。例示性的“效应器 功能”包括Clq结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细 胞毒性(ADCC)、吞噬、细胞表面受体(例如B细胞受体(BCR))的下调等。此类效应器功能 一般要求Fc区与结合域(例如抗体可变域)组合，而且可以使用本领域已知的用于评估此 类抗体效应器功能的各种测定法来加以评估。“天然序列Fc区”包含与在自然界中找到的Fc区的氨基酸序列同样的氨基酸序

　　9列。“变异Fc区”包含由于至少一处氨基酸修饰而与天然序列Fc区的氨基酸序列不 同的氨基酸序列。优选的是，变异Fc区与天然序列Fc区或亲本多肽的!^c区相比具有至少 一处氨基酸替代，例如天然序列Fc区或区别多肽的Fc区中约1处至约10处氨基酸替代和 优选约1处至约5处氨基酸替代。本文中的变异Fc区会优选与天然序列Fc区和/或区别 多肽的Fc区具有至少约80%序列同一性和最优选至少约90%序列同一性、更优选至少约 95%序列同一性。“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”是指一种细胞介导的反应，其中表达 Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性细胞、和巨噬细 胞)识别靶细胞上所结合的抗体并随后引起靶细胞的溶解。介导ADCC的主要细胞，即NK 细胞，只表达Fc γ RIII，而单核细胞表达Fc γ RI、Fc γ RII和Fc γ RIII。为了评估感兴趣分 子的ADCC活性，可实施体外ADCC测定，诸如美国专利No. 5，500，362或5，821，337中所记 载的。对于此类测定法有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细 胞。或者/另外，可在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes 等，PNAS(USA)95 :652-656(1998)中所披露的。“百分比(％ )氨基酸序列同一性”在本文中定义为比对序列并在必要时引入缺口 以实现最大百分比序列同一性后，且在不将任何保守替代视为序列同一性的一部分的条件 下，候选序列中与所选择序列中的氨基酸残基同样的氨基酸的百分比。用于测定百分比氨 基酸序列同一性的比对可以以本领域技术范围内的多种方式来实现，例如使用公众可获得 的计算机软件诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign (DNASTAR)软件。本领域技 术人员可决定用于测量比对的适宜参数，包括在所比较序列的全长上实现最大比对所需要 的任何算法。然而，就本文而言，％氨基酸序列同一性值是如下文所描述的使用序列比较计 算机程序ALIGN-2获得的。ALIGN-2序列比较计算机程序是由Genentech公司创作的，已经 与用户文档一起提交给美国版权局(U. S. Copyright Office, Washington D. C.，20559)，登 记为美国版权注册号TXU510087，而且公众可通过Genentech公司(South San Francisco, Calif.)获得。ALIGN-2程序应当编译成在UNIX操作系统、优选数字UNIX V4. OD上使用。 所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不再变化。就本文而言，给定氨基酸序列A对(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸 序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为给定氨基酸序列A具有或包含对、与、或针对 给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性)如下计算100乘以分数X/Y，其中X是序 列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基数目，且其中Y 是B中的氨基酸残基总数。应当理解的是，若氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的 长度，则A对B的％氨基酸序列同一性会不等于B对A的％氨基酸序列同一性。“分离的”多肽指已经鉴定且与/自其天然环境的成分分开和/或回收的多肽。所 谓其天然环境的污染成分，是指会干扰该多肽的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、 和其它蛋白质性或非蛋白质性的溶质。在优选的实施方案中，多肽会被纯化(1)至超过 95% (以多肽的重量计，如通过Lowry法所测定的)和最优选超过99% (以重量计)；(2) 至足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端氨基酸序列或内部氨基酸序列 的程度，或( 至通过还原性或非还原性条件下SDS-PAGE并使用考马斯蓝或优选银染色显示均质。分离的多肽包括重组细胞内原位的多肽，这是因为其中不会存在多肽天然环境的 至少一种成分。然而，通常会通过至少一个纯化步骤来制备分离的多肽。靶物还可以是所述靶物的片段。如此，靶物还是所述靶物的能够引发免疫应答的 片段。靶物还是所述靶物的能够结合针对全长靶物生成的单域抗体的片段。片段，在用于本文时，指序列的小于100% (例如99%、90%、80%、70%、60%、 50%,40%,30%,20%,10%^ )，但是包含 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、21、22、23、M、25或更多个氨基酸。片段的长度足以使感兴趣的相互作用维持IxKTfiM或 更好的亲和力。片段在用于本文时还指如下所述的一个或多个任选的氨基酸的插入、删除和替 代，所述插入、删除和替代基本上不改变该靶物与针对全长靶物生成的单域抗体结合的能 力。氨基酸插入、删除或替代的数目优选多至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、 42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、 67、68、69或70个氨基酸。术语“治疗有效量”指在哺乳动物中有效治疗疾病或病症的药物量。在癌症的情 况中，药物的治疗有效量可减少癌细胞的数目；缩小肿瘤的尺寸；抑制(即在一定程度上减 缓，优选阻止)癌细胞浸润到周围器官中；抑制(即在一定程度上减缓，优选阻止)肿瘤转 移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上减轻一种或多种与病症有关的症状。 以药物可阻止生长和/或杀死现有癌细胞为限，药物可以是细胞抑制性的和/或细胞毒性 的。对于癌症治疗，可通过例如评估疾病进展前时间(time to disease progression,TTP) 和/或测定响应率(response rate, RR)来测量体内功效。氨基酸序列或化合物的半衰期可一般性地定义为多肽的血清浓度在体内降低 50% (例如由于序列或化合物的的降解和/或天然机制对序列或化合物清除或隔离)所花 费的时间。可以以本身已知的任何方式来测定半衰期，诸如通过药动学分析。合适的技术对 于本领域技术人员会是清楚的，而且例如一般包括下述步骤对灵长类动物适当施用合适 剂量的要处理的氨基酸序列或化合物；以规则时间间隔自所述灵长类动物收集血液样品或 其它样品；测定本发明的氨基酸序列或化合物在所述血液样品中的水平或浓度；并从如此 获得的数据(图)计算到本发明的氨基酸序列或化合物的水平或浓度与给药后的初始水平 相比降低50%时的时间。参考例如标准手册，诸如Kenneth，A等，Chemical Stability of Pharmaceuticals :A Handbook for Pharmacists^PetersPharmacokinete analysis A Practical Approach(1996)。还可参考Pharmacokinetics ,M Gibaldi 禾口D Perron, Marcel Dekker 出版，第二修订版(1982)。半衰期可以使用诸如tl/2-α ,tl/2-β和曲线下面积(AUC)等参数来表述。在本 说明书中，“半衰期延长”指这些参数之任一项，如这些参数之任两项，或实质上所有这三项 参数的增大。“半衰期延长”尤其指tl/2-β的增大，同时有或无tl/2-α和/或AUC或二 者的增大。在用于本文时，术语“多价”指整合有两个或更多个生物学活性区段的重组分子。 形成多价分子的蛋白质片段任选可经由多肽接头连接，该多肽接头搭接各组成部分并容许 各组成部分独立发挥功能。

　　概览本申请提供包含两个或更多个基于纤连蛋白的支架蛋白，诸如而3结构域的多价 多肽。各而3结构域可结合相同靶物(从而提高效价并因此提高靶物结合亲合力)或不同 靶物(从而展现多种效应器功能)。美国专利No. 6，818，418记载了可共价或非共价连接的纤连蛋白支架多聚体。本 申请描述改良的多聚体，它们藉由多肽接头共价键合，从而容许多价多肽作为单一构建物 表达。本申请部分基于下述令人惊讶的发现，即藉由多肽接头连接的各而3结构域彼此独 立地正确折叠，保留高亲和力结合，而且每个结构域保留其功能特性。基于纤连蛋白的支架本申请的一个方面提供包含藉由多肽连接的至少两个而3结构域的多肽，其中每 个Fn3结构域结合靶物分子。每个Fn3结构域包含AB环、BC环、CD环、DE环、EF环、和FG 环。在一些实施方案中，而3结构域是自人纤连蛋白衍生的而3结构域，特别是纤连蛋 白的第十而3结构域(1(lFn3)，如SEQ ID N0:1中所示。已经报告了多种突变型1QFn3支架。 在一个方面，Asp 7, Glu 9、和Asp 23中的一个或多个被替换成另一种氨基酸，例如不带负 电荷的氨基酸残基(例如AsruLys、等)。已经报告了这些突变具有与野生型相比促进突变 型1(^η3在中性pH的更大稳定性的效果(参见PCT公开文本No. W002/04523)。已经公开 了 1QFn3支架中其他多种有益或中性的改变。参见例如Batori等，Protein Eng. 2002Dec ； 15(12) :1015-20 ；Koide 等，Biochemistry 200IAug 28 ；40 (34) :10326_33。变体型和野生型wFM蛋白都具有相同的结构特征，即七个β链结构域序列(称 作A-G)和连接前述七个β链结构域序列的六个环区(AB环、BC环、CD环、DE环、EF环、和TO 环)。位置与N-和C-末端最接近的β链在溶液中可采取β样构象。在SEQ ID Ν0:1中， AB环对应于残基15-16，BC环对应于残基21-30，CD环对应于残基39-45，DE环对应于残基 51-56，EF 环对应于残基 60-66，而 FG 环对应于残基 76-87 (Xu et al. , Chemistry&BioIogy 20029 =933-942)。BC、DE和TO环沿着分子的一个面排列，而AB、CD和EF环沿着分子相对 面排列。在SEQ ID N0:1中，β链A对应于残基9-14，β链B对应于残基17-20，β链C 对应于残基31-38，β链D对应于残基46-50，β链E对应于残基57-59，β链F对应于残 基67-75，而β链G对应于残基88-94。各链经由相应的环彼此连接，例如链A和B藉由环 AB连接形成链Α、环ΑΒ、链B的排列，等等。涉及形成疏水性核心的残基(“核心氨基酸残 基”)包括与SEQ ID NO :1的下述氨基酸对应的氨基酸L8、V10、A13、L18、I20、W22、TO2、 134、Y36、F48、V50、A57、159、L62、Y68、170、V72、A74、188、190 和 Y92，其中核心氨基酸残 基用单字母氨基酸代码后加它们在SEQ ID NO :1内的位置来表示。参见例如Dickinson et al.，J. Mol. Biol. 236 1079-1092 (1994)。在一些实施方案中，1°! 多肽可以与SEQ ID NO 1中所示人1QFn3结构域至少 40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、或90%相同。大部分变异性一般会存在于 一个或多个环中。iciI7I^多肽的每个β或β样链可以基本上由与SEQ ID NO 1的对应β 或β样链的序列至少80^^85%,90^^95%或100%相同的氨基酸序列组成，只要这样的 变异不破坏多肽在生理学条件中的稳定性。在一些实施方案中，本公开内容提供包含第十纤连蛋白III型(1(1而3)结构域的多肽，其中lFr^结构域包含环AB、环BC、环CD、环DE、环EF、和环FG，且选自环BC、DE和FG中 的至少一个环具有相对于人kiFM结构域的相应环的序列为改变的氨基酸序列。在一些实 施方案中，BC和re环是改变的。在一些实施方案中，BC、DEJP re环是改变的，即而3结构 域包含非天然存在的环。“改变的”指一处或多处相对于模板序列(对应的人纤连蛋白结构 域)的氨基酸序列改变，包括氨基酸添加、删除、和替代。氨基酸序列的改变可通过有意的、 盲目的、或自发的序列(一般是核酸编码序列)变异来实现，而且可通过任何技术来实施， 例如PCR、易错PCR、或化学DNA合成。在一些实施方案中，选自BC、DEjnre的一个或多个环的长度可以相对于相应的 人纤连蛋白环延长或缩短。在一些实施方案中，环的长度可以延长2-25个氨基酸。在一些 实施方案中，环的长度可以缩短1-11个氨基酸。具体而言，kiFM的re环长12个残基，而 抗体重链中的相应环的范围为4- 个残基。因此，为了优化抗原结合，1(1而3的re环的长 度优选在长度以及序列方面改变以覆盖4- 个残基的CDR3范围，以获得最大可能的抗原 结合灵活性和亲和力。在一些实施方案中，多肽包含如下的第一而3结构域，其包含与SEQ IDNO 1的非 环区至少80，85，90，95，98，或100 %相同的氨基酸序列，其中至少一个选自BC，DE，和TO的 环是改变的。在一些实施方案中，多肽包含如下的第二而3结构域，其包含与SEQ ID NO 1 的非环区至少80，85，90，95，98，或100%相同的氨基酸序列，其中至少一个选自BC, DE，和 re的环是改变的。在一些实施方案中，改变的BC环具有最多10处氨基酸替代、最多4处氨 基酸删除、最多10处氨基酸插入、或其组合。在一些实施方案中，改变的DE环具有最多6 处氨基酸替代、最多4处氨基酸删除、最多13处氨基酸插入或其组合。在一些实施方案中， re环具有最多12处氨基酸替代、最多11处氨基酸删除、最多25处氨基酸插入或其组合。10Fn3结构域一般以SEQ ID NO=I的氨基酸编号1开始。然而，本发明也涵盖具有 氨基酸删除的结构域。在一些实施方案中，SEQ ID NO :1的前8个氨基酸被删除。N端或C 端也可添加额外的序列。例如，可以将额外的MG序列置于而3结构域的N端，特别是第一 而3结构域的N端。M通常会被切掉，留下G在N端。在一些实施方案中，序列可置于kiFM 结构域的C端，例如SEQID N0:17，18，或19。在其它实施方案中，置于C端的序列可以是 SEQ ID NO: 17，18或19的C端截短片段，包括例如下述氨基酸序列之一(用单字母氨基酸 代码表示):E, EI, EID, EIDKP (SEQ ID NO 50), EIDKPS (SEQ ID NO 51)，或 EIDKPC(SEQ ID NO 52)。在一些实施方案中，多肽包含如下的第一和/或第二 kiFM结构域，其中BC环具 有氨基酸序列SEQ ID NO 2, DE环具有氨基酸序列SEQ ID NO :3，而TO环具有氨基酸序列 SEQ ID N0:4，其中而3结构域结合IGF4R。在一些实施方案中，多肽包含如下的第一和/ 或第二 wFM结构域，其中BC环具有氨基酸序列SEQ ID NO :5，DE环具有氨基酸序列SEQ ID NO :6，而TO环具有氨基酸序列SEQ ID NO :7，其中而3结构域结合VEGFR2。在一些实施 方案中，多肽包含SEQ ID N0:8-15J9-31和63-70中的任一氨基酸序列。在一些实施方案 中，多肽包含与 SEQ ID NO :8-15,29-31 和 63-70 中任一序列至少 70，75，80，85，90，95，或 100%相同的氨基酸序列。纤连蛋白天然地借助其整联蛋白结合基序“精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸”(RGD)结 合某些类型的整联蛋白。在一些实施方案中，多肽包含缺少该(RGD)整联蛋白结合基序的10Fn3结构域。在一个实施方案中，多价多肽包含具有结构A-B-C的多肽，其中A为包含结合 VEGFR2的结构域、基本上由结合VEGFR2的结构域组成、或由结合VEGFR2的1QFn3 结构域组成的多肽，B为多肽接头，而C为包含结合IGF-IR的1(1而3结构域、基本上由IGF-IR 的kiFM结构域组成、或由IGF-IR的1(1而3结构域组成的多肽。在另一个实施方案中，多价 多肽包含具有结构A-B-C的多肽，其中A为包含结合IGF4R的1(1而3结构域、基本上由结合 IGF-IR的1(1而3结构域组成、或由结合IGF4R的kiFM结构域组成的多肽，B为多肽接头，而 C为包含结合VEGFR2的1QFn3结构域、基本上由结合VEGFR2的结构域组成、或由结合 VEGFR2的1(1而3结构域组成的多肽。具有结构A-B-C的多价多肽的具体例子是包含下述各 项的多肽⑴具有SEQ ID NO :8-15,29-31和63-70任一所列氨基酸序列的多肽；或(ii) 包含与SEQ ID NO :8-15, 29-31和63-70任一所列氨基酸序列至少85%, 90%, 95%, 97%, 98%，或99%相同的氨基酸序列的多肽。在某些实施方案中，所述A区或C区是包含结合VEGFR2的1(1而3结构域的多肽，其 中1(^η3结构域具有如下的结构(自N端至C端)β链Α、环ΑΒ、β链B、环BC、β链C、环 ⑶、β链D、环DE、β链Ε、环EF、β链F、环TO、β链G，其中BC环具有氨基酸序列SEQ ID NO :5，DE环具有氨基酸序列SEQ IDNO :6，而TO环具有氨基酸序列SEQ ID N0:7，其中1QFn3 结构域折叠成抗体重链可变区样结构，且其中多肽以小于IOOnM的Kd结合VEGFR2。结合 VEGFR2的1(1而3结构域优选折叠成如下的结构，其中7条β链分布在两个β片层之间，这 两个β片层彼此相对挤压，形成一个稳定的核心，且其中各β链通过6个环连接，这些环 暴露于溶剂。在例示性的实施方案中，kiFM结构域长度为80-150个氨基酸。在某些实施方案中，A区或C区是结合VEGFR2的1(^η3结构域，其包含具有 氨基酸序列SEQ ID NO :5的BC环、具有氨基酸序列SEQ ID NO :6的DE环、和具有氨 基酸序列SEQ ID NO :7的TO环，其中该1Vr^结构域以小于IOOnM的Kd结合VEGFR2。 一种例示性的VEGFR2结合物用下述序列表示=EWAATX…SLLIXd SWRHPHFPTR Xa2YYRITYGEXn2MFTVXa3 PLQPPT X.,ATIX^DYTITVYAVXa5 TDGRNGRLLSIP XjJSINYRT (SEQ ID NO :47)。在SEQ ID NO :47中，BC、DE和TO环具有以粗体显示的固定序列，AB环用)(nl表示， CD环用‘表示，而EF环用Xn3表示，而β链A-G标有下划线。X代表任意氨基酸，而X后面 的下标代表氨基酸数目的整数。具体而言，nl可以是1-15，2-15，1-10, 2-10,1-8, 2-8,1-5, 2-5，1-4，2-4，1-3，2-3,或1-2个任意数目基酸；而n2和n3可以各自独立地是2-20, 2-15, 2-10，2-8，5-20，5-15，5-10，5-8，6-20，6-15，6-10，6-8，2-7，57，或 6-7 个氨基酸；而 al_a6 可以各自独立地包含0-10，0-5，1-10，1-5，或2-5个氨基酸。在优选的实施方案中，nl是2 个氨基酸，n2是7个氨基酸，n3是7个氨基酸，而al_a6是0个氨基酸。各β链的序列可 以在所有7个支架区间相对于SEQ ID NO :1所示相应氨基酸序列具有0-10，0-8，0-6，0-5， 0-4，0-3，0-2，或0-1处替代、删除或添加。在一个例示性的实施方案中，β链的序列在所 有7个支架区内可以相对于SEQ ID NO :1所示的相应氨基酸序列具有0-10，0-8，0-6，0-5， 0-4，0-3，0-2，或0-1处保守替代。在某些实施方案中，核心氨基酸残基是固定的，且任意替 代、保守替代、删除或添加发生于核心氨基酸残基以外的残基。在某些实施方案中，VEGFR2 结合物用下述氨基酸序列表示

　　15X,,YYRITYGEXn,QEFTVX,, PKNVYT X^ATIXnJYTITVYAVX,. TRFRDYQP Xa6ISINYRT (SEQ ID NO 49)。在SEQ ID NO 49中，BC、DE和TO环具有以粗体显示的固定序列，AB环用)(nl表 示，⑶环用‘表示，而EF环用Xn3表示，而β链A-G标有下划线。X代表任意氨基酸，而 X后面的下标代表氨基酸数目的整数。具体而言，nl可以是1-15，2-15，1-10, 2-10,1-8, 2-8，1-5，2-5，1-4，2-4,1-3, 2-3,或 1-2 个氨基酸；n2 和 n3 可以各自独立地是 2-20, 2-15, 2-10，2-8，5-20，5-15，5-10, 5-8，6-20，6-15，6-10，6-8，2-7, 5-7,或 6-7 个氨基酸；而 al_a6 可以各自独立地包含0-10，0-5，1-10，1-5，或2-5个氨基酸。在优选的实施方案中，nl是 2个氨基酸，n2是7个氨基酸，n3是7个氨基酸，而al_a6是0个氨基酸。各β链的序 列在所有7个支架区内相对于SEQ ID Ν0:1所示的相应氨基酸序列可以具有0-10，0-8， 0-6，0-5，0-4，0-3，0-2，或0-1处替代、删除或添加。在一个例示性的实施方案中，β链 的序列在所有7个支架区内相对于SEQ ID NO :1所示的相应氨基酸序列可以具有0-10， 0-8，0-6，0-5，0-4，0-3，0-2，或0-1处保守替代。在某些实施方案中，核心氨基酸残基是 固定的，且任意替代、保守替代、删除或添加发生于核心氨基酸残基以外的残基。在某些 实施方案中，IGF-IR结合物用下述氨基酸序列表示=EVVAATPT SLLI SWSARLKVAR YYRITYGETGGNSPVQEFTV PKNVYT AT ISGLKPGVDYTITVYAV TRFRDYQP ISINYRT (SEQ ID NO 35)。在SEQ ID NO :35中，BC、DE和re环的序列具有以粗体显示的固定序列(例如具有 氨基酸序列SEQ ID NO :2的BC环，具有氨基酸序列SEQ ID NO :3的DE环，和具有氨基酸序 列SEQ ID NO :4的TO环)，而其余标有下划线条β链及ΑΒ、⑶和EF环的序 列)相对于SEQ ID NO :35所示的相应氨基酸序列具有0-20，0-15，0-10，0-8，0-6，0-5，0-4， 0-3，0-2，或0-1处替代、保守替代、删除或添加。在某些实施方案中，核心氨基酸残基是固 定的，且任意替代、保守替代、删除或添加发生于核心氨基酸残基以外的残基。结合IGF-IR 的10Fn3结构域可以任选包含长度1-20，1-15，1-10,1-8,1-5,1-4,1-3,1-2，或1个氨基酸的 N端延伸。例示性的N端延伸包括(用单字母氨基酸代码表示)M，MG, G，MGVSDVPRDL(SEQ ID NO 45) ,VSDVPRDL (SEQ ID NO :46)，和 GVSDVPRDL (SEQ ID NO :48)，或者 SEQ ID NO :45, 46或48任一的N端截短片段。其它合适的N端延伸包括例如XnSDVPRDL (SEQ ID NO :53)， XnDVPRDL(SEQ ID NO 54), XnVPRDL (SEQ ID NO 55), XnPRDL(SEQ IDNO 56)，XnRDL(SEQ ID NO 57)，XnDL (SEQ ID NO :58)，或 XnL，其中 η = 0，1 或 2 个氨基酸，其中当 η = 1 时，X 是 Met或Gly，而当η = 2时，X是Met-Gly。结合IGF4R的结构域可以任选包含C端尾。 例示性的C端尾包括长度为1-20，1-15，1-10，1-8，1-5,1-4,1-3,1-2，或1个氨基酸的多肽。 C端尾的具体例子包括EIDKPSQ (SEQ ID NO 17), EIDKPCQ (SEQ ID NO 18)，和 EIDK (SEQ ID Ν0:19)。在其它实施方案中，合适的C端尾可以是SEQ ID NO 17，18或19的C端截短片 段，包括例如下述氨基酸序列之一(用单字母氨基酸代码表示)E，EI，EID，EIDKP (SEQ ID NO 50), EIDKPS (SEQ ID NO :51)，或 EIDKPC (SEQ ID NO :52)。其它合适的 C 端尾包括例如 ES, EC, EGS, EGC, EGSGS (SEQ ID NO :71)，或 EGSGC (SEQ ID NO :72)。在某些实施方案中，结 合IGF-IR的1(1而3结构域包含N端延伸和C端尾二者。在例示性的实施方案中，A区包含 以Gly或Met-Gly开始的N端延伸和不含半胱氨酸残基的C端延伸，而B区包含不以Met开 始的N端延伸和包含半胱氨酸残基的C端延伸。结合IGF4R的结构域的具体例子是包含下述各项的多肽⑴具有SEQ IDNO :26-27和35-39任一所列氨基酸序列的多肽；或 (ii)包含与SEQ ID NO J6-27和35-39任一所列氨基酸序列至少85%，90%，95%，97%， 98 %，或99 %相同的氨基酸序列的多肽。B区是多肽接头。例示性的多肽接头包括具有1-20，1-15，1-10，1-8，1-5，1-4， 1-3，或1-2个氨基酸的多肽。合适的多肽接头的具体例子在本文中有进一步描述。在某些 实施方案中，接头可以是本文所述的C端尾多肽、本文所述的N端延伸多肽、或其组合。在一个实施方案中，多价多肽包含具有结构A-A-X2-B-X3-C-X4的多肽，其中&是 任选的N端延伸，A是结合VEGFR2的1(1而3结构域，X2是任选的C端尾，B是多肽接头，X3是 任选的N端延伸，C是结合IGF-IR的wFM结构域，而\是任选的C端尾。在另一个实施方 案中，多价多肽包含具有结构A-A-X2-B-X3-C-X4的多肽，其中\是任选的N端延伸，A是结 合IGF-IR的wFM结构域，X2是任选的C端尾，B是多肽接头，X3是任选的N端延伸，C是结 合VEGFR2的wFM结构域，而&是任选的C端尾。上文描述了合适的N端延伸和C端尾的 具体例子。在某些实施方案中，X1、&、B、&或&中的一个或多个可以包含适合于PEG化的 氨基酸残基，诸如半胱氨酸或赖氨酸残基。在例示性的实施方案中，&包含至少一个适合于 PEG化的氨基酸残基，诸如半胱氨酸或赖氨酸残基。下文进一步描述了合适的多肽接头的具 体例子。具有结构A-A-X2-B-X3-C-X4的多价具体的具体例子是包含下述各项的多肽⑴ 具有SEQ ID N0:8-15J9-31和63-70任一所列氨基酸序列的多肽；或(ii)包含与SEQ ID NO :8-15,29-31 和 63-70 任一所列氨基酸序列至少 85%，90%，95%，97%，98%，或 99%相 同的氨基酸序列的多肽。在例示性的实施方案中，如本文中所定义的X是天然存在的氨基酸。多肽接头本申请提供包含藉由多肽接头连接的至少两个而3结构域的多价多肽。所述的多 肽包含N端结构域和C端结构域，该N端结构域包含第一而3结构域，该C端结构域包含第 二而3结构域。第一和第二而3结构域可以直接连接或藉由多肽接头间接连接。可以在 而3结构域与多肽接头之间在第一而3结构域的C端引入另外的接头或间隔物，例如SEQ ID NO 17,18，或19。可以在而3结构域与多肽接头之间在第二而3结构域的N端引入另外的 接头或间隔物。适合于连接而3结构域的接头是那些容许各别的结构域彼此独立地折叠，从而形 成容许高亲和力结合靶物分子的三维结构的接头。本申请提供了满足这些要求的合适接 头，包括基于甘氨酸-丝氨酸的接头、基于甘氨酸-脯氨酸的接头、基于脯氨酸-丙氨酸的 接头以及接头SEQ ID N0:20。本文所述实施例证明了藉由这些接头连接的而3结构域保 留它们的靶物结合功能。在一些实施方案中，接头是基于甘氨酸-丝氨酸的接头。这些接 头包含甘氨酸和丝氨酸残基，而且长度可以是8-50，10-30，和10-20个氨基酸。此类接头的 例子包括SEQ ID N0:23，M，和25。在一些实施方案中，多肽接头选自SEQID NO :21和22。 在一些实施方案中，接头是基于甘氨酸-脯氨酸的接头。这些接头包含甘氨酸和脯氨酸，而 且长度可以是3-30，10-30，和3-20个氨基酸。此类接头的例子包括SEQ ID N0:32，33，和 34。在一些实施方案中，接头是基于脯氨酸-丙氨酸的接头。这些接头包含脯氨酸和丙氨 酸，而且长度可以是3-30，10-30，3-20和6-18个氨基酸。此类接头的例子包括SEQ ID NO: 60，61和62。通过本领域公知的常规实验可以确定最佳的接头长度和氨基酸组成。在一些实施方案中，多肽接头是SEQ ID NO: 20。药动学模块在一个方面，本申请提供进一步包含药动学(PK)模块的多价多肽。改善的药动学 可依照察觉到的治疗需要来评估。往往希望提高生物利用度和/或延长给药的时间间隔， 这可能通过延长服药后蛋白质在血清中保持可利用状态的时间来实现。在有些情况下希望 改善蛋白质的血清浓度随时间的连贯性(例如缩小施药后不久的蛋白质血清浓度与下次 施药前不久的蛋白质血清浓度的差异)。可以将多肽连接于可使多肽在哺乳动物(例如小 鼠、大鼠、或人)中的清除速率相对于未修饰多肽降低超过3倍的模块。改善的药动学的其 它量度可包括血清半衰期，其常常分成α阶段和β阶段。两个阶段之一或二者可通过添 加适宜的模块来显著改善。有减缓蛋白质从血液清除的倾向的模块(在本文中称作“Hi模块”)包括聚氧化 烯模块(例如聚乙二醇)、糖(例如唾液酸)、和耐受良好的蛋白质模块(例如Fc、Fc片段、 运铁蛋白、或血清白蛋白)。多肽可以与白蛋白或白蛋白的片段(部分)或变体融合，如美 国专利申请公开文本No. 中所记载的。在一些实施方案中，Hi模块是血清白蛋白结合蛋白，诸如美国专利申请公开文本 No. 2007/0178082 和 2007/0269422 中记载的那些。在一些实施方案中，PK模块是血清免疫球蛋白结合蛋白，诸如美国专利申请公开 文本No. 2007/0178082中记载的那些。在一些实施方案中，多价多肽包含聚乙二醇(PEG)。可以将一个或多个PEG分子 连接于蛋白质上的不同位置，这样的连接可通过与胺、硫醇或其它合适的反应性基团的反 应来实现。胺模块可以是例如存在于多肽N端的伯胺或存在于氨基酸(诸如赖氨酸或精氨 酸)中的胺基。在一些实施方案中，PEG模块连接于多肽上选自下组的位置a)N末端；b)N 末端与最N端的β链或β样链之间；c)位于多肽的与靶物结合位点相对的面上的环；d)C 末端与最C端的β链或β样链之间；和e)C末端。PEG化可通过定点PEG化来实现，其中将合适的反应性基团引入蛋白质中以创建 PEG化优先发生的位点。在一些实施方案中，修饰蛋白质以在期望的位置引入半胱氨酸残 基，容许半胱氨酸上的定点PEG化。在一些实施方案中，多肽包含含有Cys的接头，诸如SEQ ID NO :18，其容许定点PEG化。在一些实施方案中，在第二而3结构域(即多肽中最C端的 结构域)的3端引入含Cys的接头。PEG的分子量可以广泛变化，而且可以是分支的或线 性的。在一些实施方案中，多价多肽包含而3结构域和1 模块。在一些实施方案中，而3 结构域是kiFM结构域。在一些实施方案中，相对于单独的而3结构域，1 模块将多肽的血清 半衰期延长超过 5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、200、400、600、800、1000%

　　本申请提供包含结合第一靶物分子的第一而3结构域和结合第二靶物分子的第 二而3结构域的多价多肽。第一和第二靶物分子可以是相同的或不同的靶物分子。当第一 和第二靶物分子相同时，而3结构域(即结合环)可以是相同的或不同的。因此，第一和第 二而3结构域可以结合相同的靶物，但是表位不同。通过向环区，特别是环BC、DE、和TO中 引入序列变异，可生成结合几乎任何靶物分子的而3结构域。可以评估结合靶物分子的多肽的平衡常数(例如解离Kd)及动力学常数(例如结 合速率常数k。n和解离速率常数k。ff)。而3结构域一般会以小于500nM，IOOnM, InM, 500pM, IOOpM或更小的Kd结合靶物分子，尽管在k。ff足够低或k。n足够高的情况下可以容忍更高的 Kd值。在一些实施方案中，第一和/或第二而3结构域结合选自下组的靶物IGF_IR， FGFR, FGFRl, FGFR2, FGFR3, FGFR4, FGFR5, c_Kit，人 pl85 受体样激酶，EGFR, HER2, HER3, HER4, c-Met，叶酸受体，PDGFR, VEGFRl, VEGFR2, VEGFR3，人血管内皮生长因子(VEGF)-A, VEGF-C, VEGF-D,人 CD20,人 CD18，人 CDlla,人凋亡受体 _2 (Apo-2)，人 α 4 β 7 整联蛋白， 人GPIIb-IIIa整联蛋白，干细胞因子(SCF)，人CD3，IGF-IR，Angl, Ang2，成纤维细胞生长 因子，表皮生长因子，肝细胞生长因子，或Tie2. 3。在一些实施方案中，第一而3结构域在N 端位置且结合IGF-IR，而第二而3结构域结合VEGFR2。在一些实施方案中，第一而3结构 域在N端位置且结合VEGFR2，而第二结构域结合IGF-IR。在一些实施方案中，第一而3结 构域在N端位置且结合IGF-1R，而第二结构域结合VEGFR2。在某些实施方案中，多价多肽包含结合不同靶物的第一和第二而3结构域。在此 类实施方案中，可能期望调节某一而3结合域相对于另一而3结合域的效力。例如，如果第 -Fn3结构域的结合亲和力显著高于第二而3结构域的结合亲和力，那么第一 Fn3结构域 的生物学效果会压制第二而3结构域的效果。因而，在某些实施方案中，可能期望多价多肽 的第一和第二而3结构域的结合亲和力彼此相似，例如结合亲和力在彼此100倍，30倍，10 倍，3倍，1倍，0. 3倍或0. 1倍以内，或结合亲和力在彼此0. 1倍-10倍以内，0. 3倍-10倍 以内，0. 1倍-3倍以内，0.3倍-3倍以内，0. 1倍-1倍以内，0.3倍-1倍以内，1倍-10倍以 内，3倍-10倍以内，3倍-30倍以内，或1倍-3倍以内。多域实施方案本申请的一个方面提供进一步包含结合模块的多价多肽。在一些实施方案中，结 合模块以小于IO-fiM，1(TM，10、，10_9M，或IO-9M的Kd结合人靶蛋白质。在一些实施方案中，结合模块结合肿瘤相关靶物或抗原。在一些实施方案中，抗原 靶向会有助于多价多肽的定位(就组织分布或者提高在组织或期望细胞类型中的局部浓 度效应而言)。在一些实施方案中，结合模块结合肿瘤相关靶物或抗原，例如碳酸酐酶IX、A3、对 于 A33 抗体特异性的抗原、BrE3 抗原、CDU CDla, CD3、CD5、CD15、CD16、CD19、CD20、CD21、 CD22、CD23、CD25、CD30、CD45、CD74、CD79a、CD80、HLA-DR、NCA 95、NCA90, HCG 及其亚基、 CEA (CEACAM-5)、CEACAM-6、CSAp, EGFR、EGP-1、EGP-2、Ep-CAM, Ba733、HER2/neu、低氧诱导 因子(HIF)、KC4 抗原、KS-I 抗原、KSl-4、Le-Y、巨噬细胞抑制因子(MIF)、MAGE、MUC1、MUC2、 MUC3、MUC4、PAM-4 抗原、PSA、PSMA, RS5、S100、TAG-72、p53、生腱蛋白、IL-6、IL-8、胰岛素 生长因子-I (IGF-I)、胰岛素生长因子-II (IGF-II)、Tn 抗原、Thomson-Friedenreich 抗原、肿瘤坏死抗原、胎盘生长因子(PlGF)、17-1A抗原、血管发生标志物(例如ED-B纤连蛋 白)、癌基因标志物、癌基因产物、和其它肿瘤相关抗原。最近关于肿瘤相关抗原的报告包 括 Mizukami 等 0005，Nature Med. 11 :992-97) ；Hatfield 等 0005，Curr. Cancer Drug Targets 5:229-48) ；Vallbohmer 等(2005, J. Clin. Oncol. 23 :3536-44)；及 Ren 等(2005, Ann. Surg. 242 :55-63)，通过述及将每一篇收入本文。在一些实施方案中，结合模块选自抗体模块。抗体模块指免疫球蛋白分子和免疫 球蛋白分子的免疫学活性部分，即包含可免疫特异性地结合抗原的抗原结合位点的分子。 因此，“抗体模块”这一术语不仅涵盖完整抗体分子，而且还涵盖抗体多聚体和抗体片段以 及抗体、抗体多聚体和抗体片段的变体(包括衍生物)。抗体模块的例子包括但不限于单链 FV(SCFVS)、Fab片段、Fab片段、F(ab )2、二硫化物连接的Fv(sdFv)、和Fv。抗体模块可 以是例如单克隆的、嵌合的、人源的、或人源化的。在一些实施方案中，抗体模块选自⑴Fab片段，其具有VL、CL、VH和CHl结构域；

　　(iii)Fd片段，其具有Vh和CHl结构域；(iv) Fd片段，其具有Vh和CHl结构域，并在CHl结 构域C-末端具有一个或多个半胱氨酸残基；(ν)Fv片段，其具有抗体单臂的结构域； (vi)dAb 片段(Ward 等，Nature 341，544-546 (1989))，其由 Vh 结构域组成；(vii)分离的 ⑶R区；(viii)F(ab )2片段，一种包含通过铰链区中的二硫桥相连的两个Fab片段的二 价片段；(ix)单链抗体分子(例如单链 Fv ；scFv) (Bird 等，Science 242 :423-426(1988)； 及Huston等，PNAS(USA)85 :5879-5883(1988)) ； (χ) “双抗体”，其具有两个抗原结合位 点，包含在同一条多肽链中相连的重链可变域(Vh)和轻链可变域(参见例如EP专 利公开文本 No. 404，097 ；WO 93/11161 ；及 Hollinger 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90 6444-6448(1993))；和(xi) “线性抗体”，其包含一对串联的Fd区段(Vh-CHI-Vh-CHI)，这 些Fd区段与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区(Zapata等，Protein Eng. 8 (10) 1057-1062 (1995)；及美国专利 No. 5，641，870)。在一些实施方案中，抗体模块是单域抗体。例子包括但不限于重链抗体、天然不含 轻链的抗体、自常规的四链抗体衍生的单域抗体、工程化抗体和非衍生自抗体的单域支架 (single domain scaffolds) 0单域抗体可以衍生自任何物种，包括但不限于小鼠、人、骆 驼、美洲驼(llama)、山羊、家兔、牛。在一些实施方案中，单域抗体是天然存在的单域抗体，诸如Vra结构域。Vhh是指从 天然不含轻链的免疫球蛋白，诸如那些源自骆驼科(Camelidae)(包括骆驼、单峰驼、美洲 驼、小羊驼(vicuna)、羊驼(alpaca)和大羊驼(guanaco))的免疫球蛋白，衍生的重链可变 域，如W094/04678中所记载的。Vra分子比IgG分子小约10倍。由于已知Vhh结合“非常” 表位，诸如腔(cavities)或沟(grooves)，因此这样的Vra的亲和力可能更适合于治疗性处 理，PCT公开文本号W097/49805。在一些实施方案中，单域抗体是结合血清蛋白质的Vhh,如美国专利申请公开文本 No. 中所记载的。血清蛋白质可以是在受试者的血清中找到的任何合适蛋白 质，或其片段。在一些实施方案中，血清蛋白质是血清白蛋白、血清免疫球蛋白、甲状腺素结 合蛋白、运铁蛋白、或纤连蛋白。已经开发了多种抗体片段生产技术，它们可用于制备本发明中所使用的抗体片段。传统上，这些片段是通过对完整抗体的蛋白水解消化衍生的(参见例如Morimoto等， Journal of Biochemical and Biophysical Methods24 :107-117(1992)；及 Brerman 等， kience，229 :81 (1985))。然而，现在可以由重组宿主细胞直接生成这些片段。例如，可以 自上文所讨论的抗体噬菌体文库分离抗体片段。或者，可以自大肠杆菌直接回收Fab -SH 片段并化学偶联以形成 F (ab )2 片段(Carter 等，Bio/Technology 10:163-167(1992))。 依照另一种方法，可以自重组宿主细胞培养物直接分离F(ab )2片段。用于抗体片段生产 的其它技术对于技术人员会是显而易见的。在其它实施方案中，所选择的抗体是单链Fv片 段(scFv)。参见 WO 93/16185 ；美国专利 No. 5，571，894 ；及美国专利 No. 5，587，458。抗体 片段也可以是“线性抗体”，举例而言，如例如美国专利No. 5，641，870所述的。此类线性抗 体片段可以是单特异性的或双特异性的。在一些实施方案中，结合模块包含一种或多种avimer序列。avimer是通过 体外外显子改组和噬菌体展示从人胞外受体域发展而来的(Silverman等，2005，Nat. Biotechnol. 23 :1493-94 ；SiIverman 等，2006，Nat. Biotechnol. 24 :220)。所得多域蛋白可 包含多个独立的、与单表位结合蛋白相比可展现出改善的亲和力(有些情况下是亚纳摩尔 级)以及特异性的结合域。关于avimer的构建和使用方法的更多细节披露于例如美国专 利公开文本 No. ，, , 和 ,通 过述及将其完整收入本文。在一些实施方案中，结合模块包含一种或多种脂笼蛋白相关序列，例如 anticalins或脂笼蛋白衍生物。anticalins或脂笼蛋白衍生物是一类对多种靶分子(包 括本文中所描述的那些)具有亲和力和特异性的结合蛋白。此类蛋白质在美国专利公开文 本No. , , ，和 PCT 公开文本No. W02006/056464 中有记载。在一些实施方案中，结合模块包含一种或多种四连蛋白C型凝集素相关序列或三 连蛋白，例如四连蛋白C型凝集素或四连蛋白C型凝集素衍生物。四连蛋白C型凝集素或 四连蛋白C型凝集素衍生物是一类对多种靶分子(包括本文中所描述的那些)具有亲和 力和特异性的结合蛋白。PCT 公开文本 W02006/053568，W02005/080418, W02004/094478, W02004/039841, W02004/005335, W02002/048189, W098/056906,和美国专利公开文本 No. 记载了不同的四连蛋白C型凝集素和相关蛋白。在一些实施方案中，结合模块包含一种或多种天然锚蛋白重复蛋白，例如 DARPins(Molecular Partners)。在一些实施方案中，结合模块包含一种或多种Affibodies 。Affibodies 衍生自 葡萄球菌蛋白A的IgG结合域。可通过改变位于蛋白A结构域的结合表面附近的残基来获 得新的结合特性。在一些实施方案中，结合模块包含一种或多种基于半胱氨酸结(cysteineknot) 的蛋白质支架，即微体(Selecore/NascaCell)。在一些实施方案中，结合模块包含一种或多种Trans-bodies 。Trans-bodies 基 于运铁蛋白支架(BioResis/Pfizer)。在一些实施方案中，结合模块包含基于伽马晶体蛋白或遍在蛋白质的结合蛋白。 这些所谓的AffilinTM(Scil Proteins)分子具有这样的特征，即在蛋白质的β片层结构中从头设计了结合区。Affilin 分子已经在美国专利申请公开文本No. 中有描 述。缀合多价多肽和结合模块可藉由至少一个二硫键、肽键、多肽、聚合糖、或PEG模块连 接起来。在一些实施方案中，多价多肽和结合模块是藉由多肽连接的。在一些实施方案中， 多肽接头是SEQ ID NO 17，18，或20。在一些实施方案中，多价多肽和结合模块是藉由具有血液或靶组织中的蛋白酶可 切割的蛋白酶位点的多肽接头连接的。可利用此类实施方案释放两种以上的治疗性蛋白 质，以实现与分别生成这些蛋白质相比更好的投递或或更高的产生效率。在一些实施方案中，多价多肽和结合模块是藉由生物相容性聚合物(诸如聚合 糖)连接的。这样的聚合糖可以包含能够被血液或靶组织中的酶切割的酶切位点。可利用 此类实施方案释放两种以上的治疗性蛋白质，以实现与分别生成这些蛋白质相比更好的投 递或治疗性质或更高的产生效率。在一些实施方案中，多价多肽和结合模块是藉由聚合物接头连接的。可以利用聚 合物接头来最合适地改变各蛋白质模块间的距离，以创建具有下述一项或多项特征的蛋白 质1) 一个或多个蛋白质结构域在结合感兴趣蛋白质时的结合空间位阻降低或提高，2)蛋 白质稳定性或溶解度提高，而无需搜索别的氨基酸替代来提高稳定性或溶解度(例如溶解 度为至少约20mg/ml，或至少约50mg/ml)，3)蛋白质聚集降低，而无需搜索别的氨基酸替代 来降低稳定性(例如如通过SEC所测量的)，及4)通过添加别的结合域而使蛋白质的整体 亲合力或亲和力提高。在一些实施方案中，多价多肽包含第二 结构域，其包含接头SEQ IDNO :18。接 头序列中的半胱氨酸模块上缀合有PEG，PEG将多价多肽和结合模块连接起来。PEG化的实施方案本申请的一个方面提供连接多价多肽与非蛋白质性的聚合物。在一些实施方 案中，聚合物是聚乙二醇(“PEG”)、聚丙二醇、或聚氧化烯，如美国专利No. 4，640，835 ； 4，496，689 ；4, 301，144 ；4, 670，417 ；4, 791，192 或 4，179，337 中所记载的。在一些实施方案 中，多价多肽包含而3结构域。在一些实施方案中，聚合物是PEG模块。另外，本申请提供与 抗体模块(例如骆驼抗体及其衍生物，以及单链和单域抗体；特别是那些由微生物表达的) 和抗体样模块(例如脂笼蛋白、锚蛋白、多重Cys-Cys结构域以及四连蛋白的衍生物；特别 是那些由微生物表达的)的N或C端PEG缀合。PEG是众所周知的水溶性聚合物，其可通过商业途径获得或者可依照本领域众所 周知的方法通过乙二醇的开环聚合来制备(Sandler和Karo，PolymerSynthesis，Academic Press, New York，卷3，页138-161)。术语“PEG”广泛用于涵盖任何聚乙二醇分子，无论 大小或PEG末端的修饰，而且可以由下式来表示X-O (CH2CH2O) ^1CH2CH2OH (1)，其中η为 20-2300，X为H或末端修饰，例如CV4烃基。在一个实施方案中，本发明的PEG的一端以氢或 甲氧基终止，即X是H或CH3 (“甲氧基PEG”)。PEG可进一步包含的结合反应所必需的化学 基团；其源自分子的化学合成；或者其是为获得分子各部分间的最佳距离的间隔物。另外， 这样的PEG可以由一个或多个连接到一起的PEG侧链组成。具有超过一条PEG链的PEG称作多臂的或分支的PEG。分支的PEG可通过例如聚环氧乙烷加成至各种多元醇(包括甘油、 季戊四醇、和山梨醇)来制备。例如，可以自季戊四醇和环氧乙烷制备四臂分支PEG。分支 PEG记载于例如欧洲申请公布No. 473084A和美国专利No. 5，932，462。一种形式的PEG包 括两条经某个赖氨酸的伯氨基相连接的PEG侧链(PEG》(Monfardini，C.等，Bioconjugate Chem. 6(1995)62-69)。PEG对肽或蛋白质的缀合一般包括活化PEG，将活化后的PEG-中间体直接偶联至 目标蛋白质/肽或接头，随后将该接头活化并偶联至目标蛋白质/肽(参见Abuchowski， A.等，J.Biol. Chem.，252，3571 (1977)和 J. Biol. Chem.，252，3582 (1977)，Zalipsky 等， 禾口 Harris 等，-f ((Poly (ethylene glycol) Chemistry :Biotechnical and Biomedical Applications)) ； (J. M. Harris 编)Plenum Press :New York, 1992 ；第 21 和 22 章)。注意， 包含PEG分子的结合多肽也称作缀合蛋白质，而没有连接PEG分子的蛋白质可称作未缀合 的。所利用的PEG的大小取决于数项因素，包括多价多肽的预期用途。为了延长在身 体、血液、非血液胞外流体和组织中的半衰期，优选较大的PEG。对于体内细胞活性，优选约 10-60kDa范围的PEG，以及小于约lOOkDa、更优选小于约60kDa的PEG，但也可使用大于约 IOOkDa的大小。对于体内成像应用，可使用较小的PEG，一般小于约20kDa，它们增加半衰期 没有大PEG那么多，从而容许更快地分布和更短的半衰期。为了缀合至本发明的结合多肽， 可以选择多种分子量形式的PEG，例如约1，000道尔顿(Da)至100，OOODa (η为20-2300)。 PEG中重复单元的数目“η”是根据以道尔顿描述的分子量而估算的。优选的是，活化后的 接头上的PEG的分子量的总和适合于药用。如此，在一个实施方案中，PEG分子的分子量 不超过100，000Da。例如，如果三个PEG分子连接于接头，其中每个PEG分子具有相同的分 子量12，OOODa(每个的η为约270)，那么接头上的PEG的总分子量为约36，OOODa(总η为 约820)。连接于接头的PEG的分子量也可以是不同的，例如，在接头上的三个分子中，两个 PEG分子可以是每个5，OOODa (每个η为约110)，而另一个PEG分子可以是12，OOODa (η为 约270)。在一些实施方案中，将一个PEG模块缀合于多价多肽。在一些实施方案中，PEG模 块是约20、30、40、50、60、70、80、或90KDa。在一些实施方案中，PEG模块是约40KDa。在一些实施方案中，PEG化多价多肽含有一个、两个或更多个PEG模块。在一个实 施方案中，PEG模块结合于这样的氨基酸残基其位于蛋白质表面上和/或远离与靶物配 体接触的表面。在一个实施方案中，PEG-结合多肽中PEG的联合分子量或总分子量为约 3，OOODa至60，OOODa,或约10，OOODa至36，OOODa0在一个实施方案中，PEG化结合多肽中 的PEG是基本上线性的直链PEG。本领域技术人员能为PEG选择合适的分子量，例如根据PEG化的结合多肽会如何 用于治疗、期望的剂量、循环时间、对蛋白水解的抗性、免疫原性、和其它考虑。关于PEG及 其用于增强蛋白质性能的用途的讨论参见N. V. Katre，Advanced Drug Delivery Reviews 10 :91-114(1993)。在一些实施方案中，多价多肽与符合下式的一个聚乙二醇基团共价连 接-C0-(CH2)x-(0CH2CH2)m-0R，其中聚乙二醇基团的-C0(即羰基)与结合多肽的一个氨基 形成酰胺键；R是低级烃基；χ是2或3 ;m是约450至约950 ；并且选择η和m使得缀合物减 去结合多肽的分子量为约10_40kDa。在一个实施方案中，结合多肽的赖氨酸氨基是可利用的(游离的)氨基。在一个具体的实施方案中，使用PEG的碳酸酯来形成PEG-结合多肽缀合物。可以 在与PEG的反应中使用N，N’ - 二琥珀酰亚氨基碳酸酯(DSC)来形成有活性的混合PEG-琥 珀酰亚氨基碳酸酯，其随后可以与接头的亲核基团或结合多肽的氨基起反应(参见美国专 利No. 5，281，698和美国专利No. 5，932，462)。在一种类似类型的反应中，可以使1，1，_(二 苯并基)碳酸酯和二-(2-吡啶基)碳酸酯与PEG起反应以分别形成PEG-苯并基 和PEG-吡啶基混合碳酸酯(美国专利No. 5，382，657)。多价多肽的PEG化可依照本领域已知方法来实施，例如通过结合多肽与亲电子活 性 PEG 的反应(供应商Shearwater Corp.，USA, 。本发明的 优选PEG试剂是例如N-羟基琥珀酰亚氨基丙酸酯(PEG-SPA)、丁酸酯(PEG-SBA)、PEG-琥 珀酰亚氨基丙酸酯或分支的N-羟基琥珀酰亚胺诸如mPEG2-NHS (Monfardini，C。